案件导入：谁让阳性克隆“失踪”了？
你是某生物制药研发项目的质控人员。研发小组报告称获得了 EGFP/pET-28a 重组阳性克隆，但有些样品出现“PCR有条带、双酶切不完整”“浓度看似足够、酶切却失败”等疑点。请你通过虚拟实验完成菌落PCR、质粒小提、浓度与纯度测定、限制性酶切、电泳判读，并给出证据链诊断。
建立 PCR、质粒提取、单酶切、双酶切和凝胶电泳之间的证据链。
真实实验一旦漏加试剂、编号错误或上样错位，难以及时重来和观察错误后果。
系统允许你观察不同操作带来的异常凝胶，并由AI质控官解释背后的实验原理。
先填写小组信息
选择虚拟情境
课堂试运行建议使用“教学标准情境”，更突出“实验错误导致阳性克隆失踪”的教学价值。
1. AI准入闯关：没有过关，不进实验台
闯关题把实验SOP中的关键参数变成操作前检查点。目标不是背答案，而是让学生在进入虚拟实验台前知道“后面要看什么证据”。
2. 菌落PCR虚拟操作台
请完成样品标记、PCR主混合液配制、每管20 μL体系确认，以及PCR仪程序设置。系统会根据你的操作生成PCR电泳结果。你可以故意做错，然后观察异常条带和证据链断裂风险。
2.1 样品追踪
虚拟质控规则：PCR管、摇菌管、质粒管和泳道记录必须形成同一编号链。编号错误时，即使出现条带，也不能作为有效证据。
2.2 模板加入方式
菌落PCR可以直接利用菌体热解后暴露的DNA作为模板，但模板过多、混淆或把模板加入总主混合液，都会影响扩增和样品证据链。
2.3 PCR主混合液配制考察：先判断“配几份”，再判断“哪些组分能一起混”
A. 反应份数与损耗预留
B. 哪些组分进入Master Mix？
质控要点：Premix、上下游引物和ddH₂O可统一配成主混合液；模板/菌体不应进入主混合液，否则S1/S2/S3会发生样品混合或交叉污染。
2.4 主混合液总体积计算
请先独立填写你计算的总量，再点击“检查主混合液配制”。点击检查后，系统才会显示按推荐份数计算的期望值。
| 组分 | 每份Master Mix体积/μL | 你计算的总量/μL | 系统期望（点击检查后显示） |
|---|---|---|---|
| rTaq Premix | 10 | ||
| 上游引物，5 μM | 1 | ||
| 下游引物，5 μM | 1 | ||
| ddH₂O | 7 | ||
| Master Mix总量 | 19 | 76 μL | 76 μL |
2.5 每管PCR反应体系确认，总体积20 μL
| 组分 | 你的体积/μL | 质控提示 |
|---|---|---|
| rTaq Premix | 主混合液中的核心酶/底物体系 | |
| 上游引物，5 μM | 与载体序列对应 | |
| 下游引物，5 μM | 与目的片段序列对应 | |
| 模板 | 必须逐管单独加入，教学仿真按1 μL计算 | |
| ddH₂O | 主混合液中补足至每管19 μL；加模板后为20 μL | |
| 总量 | 20.0 | 待检查 |
2.6 PCR仪程序设置：按热循环仪的“梯形图”逐段选择
3. PCR产物电泳与判读
PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶，DL2000 Marker。目标片段约292 bp。请先观察虚拟胶图，再填写判读。
PCR虚拟凝胶
学生判读
4. 摇菌与质粒小提虚拟操作台
这一模块把“机械照做P1/P2/P3”改成可视化质控：你选择的混匀方式、P2裂解时间、吸柱晾干时间会影响DNA浓度、纯度和后续酶切。
4.1 摇菌设置
4.2 菌种保存
这一操作不直接决定酶切条带，但体现生物样品追踪和复核能力。
4.3 质粒小提关键节点
5. DNA浓度/纯度判断与酶切体系计算
请根据测得的浓度计算加入1 μg质粒DNA所需体积，并判断是否能在20 μL体系中完成单酶切或双酶切。
5.1 体系计算器
| 单酶切体系：20 μL | ||
|---|---|---|
| 组分 | 固定用量/说明 | 你的计算/μL |
| 质粒DNA，1 μg | 根据所选样品浓度计算 | |
| SphⅠ | 1 μL | 1 |
| Quick cut Buffer | 2 μL | 2 |
| ddH₂O | 补足至20 μL | |
| 双酶切体系：20 μL | ||
|---|---|---|
| 组分 | 固定用量/说明 | 你的计算/μL |
| 质粒DNA，1 μg | 根据所选样品浓度计算 | |
| SphⅠ | 1 μL | 1 |
| NotⅠ | 1 μL | 1 |
| 10×H Buffer | 2 μL | 2 |
| 0.1%BSA | 2 μL | 2 |
| ddH₂O | 补足至20 μL | |
5.2 纯度判断
6. 限制性酶切与酶切电泳
单酶切用于观察重组质粒线性化，预期约6067 bp；双酶切用于切出载体片段和目的片段，预期约4942 bp与1125 bp。请设置酶切体系并运行虚拟凝胶。
6.1 单酶切体系
6.2 双酶切体系
6.3 共用质控条件
酶切虚拟凝胶
7. AI证据链诊断与实验报告草稿
真实的阳性克隆鉴定不能只写“PCR有条带，所以成功”。请把PCR、质粒纯度、单酶切、双酶切和样品追踪合并成证据链。